Lo scorso 18 Settembre si è svolto, presso l'Hotel Lipari di Sciacca, un Focus dal titolo: "Dal caso clinico al trattamento".
Il convegno, organizzato dalla dott.ssa Calogera Gerardi, responsabile del servizio di microcitemia dell'Azienda Ospedaliera di Sciacca, con il sostegno dell'Associazione Piera Cutino, della Lega Regionale per la lotta contro le Emoglobinopatie ed i Tumori dell'infanzia e dalla Regione Siciliana - Azienda Ospedaliera di Sciacca, ha affrontato alcune tematiche relative alle più frequenti anemie ereditarie in Sicilia.
Al convegno hanno partecipato i maggiori esperti nel campo delle anemie ereditarie e numerosi argomenti scientifici, nonché interessanti casi clinici, sono stati presentati. Si è parlato di anemie da alterazioni di membrana, di Talassemie e di Emocromatosi.
Uno dei principali argomenti trattati, che in questi ultimi anni ha registrato notevoli progressi nella diagnostica clinica e di laboratorio, è stato quello sulle patologie di membrana del globulo rosso.
La membrana del globulo rosso ha una struttura tale da conferire ampia elasticità al globulo rosso. In particolare il citoscheletro, la struttura sottostante lo strato lipidico, è costituito da una fitta maglia di proteine, alcune delle quali sono posizionate verticalmente e ancorate a quelle posizionate orizzontalmente. Il deficit di una o più proteine è responsabile dell’alterazione del citoscheletro, con conseguente perdita di membrana e alterazioni morfologiche.
La sferocitosi ereditaria (SE) è la più comune tra le anemie emolitiche congenite croniche dovute ad anomalie delle proteine di membrana dei globuli rossi.
La malattia è diffusa in tutto il mondo ed è la principale causa di anemia ereditaria nel Nord Europa e negli Stati Uniti, dove la frequenza della malattia è di circa 1/1.000-2.000. Una forma più lieve della malattia è diffusa anche in Giappone mentre sembra più rara in Africa e nel Sud Est Asiatico. Si trasmette per lo più con eredità autosomica dominante (75%). Il difetto primario è la perdita di superficie della membrana del globulo rosso attraverso il rilascio di piccole goccioline di membrana, che causa la trasformazione sferoidale del globulo rosso e pertanto la sua aumentata fragilità. La distruzione dei globuli rossi anomali avviene nella milza.
La perdita della membrana è dovuta a un difetto di una delle numerose proteine di membrana, tra cui l’anchirina, la banda 3, la ß spectrina, la alfa spectrina e la proteina 4.2.
La SE si presenta con manifestazioni cliniche di severità variabile (forma lieve, moderata e severa) con quadri da molto sfumati e difficilmente diagnosticabili, a forme severe che richiedono terapia trasfusionale periodica. Tipici sono: anemia, reticolocitosi, splenomegalia, ittero intermittente e colelitiasi. L’anemia può anche essere assente o molto moderata quando l’emolisi è ben compensata. Reperto pressoché costante è l’aumento della conta reticolocitaria, come indice dell’aumentato turnover midollare. L’ittero è variabile e spesso assente, ed è solito aumentare quando il midollo è sottoposto ad altri eventi stressanti intercorrenti, come le infezioni. La splenomegalia è in genere moderata, ma nei soggetti adulti può raggiungere dimensioni notevoli. I bambini con Se severa possono richiedere trasfusioni, specie nei primi anni di vita; il trattamento con eritropoietina può ridurre la richiesta trasfusionale. Dopo il periodo iniziale, raramente si ricorre alla terapia trasfusionale.
Gli elementi per la diagnosi
Il percorso diagnostico deve prevedere una fase iniziale di anamnesi (storia familiare e del paziente), una di diagnostica clinica ed una di diagnostica di laboratorio.
Per i test di laboratorio, è opportuno iniziare con gli esami di routine effettuati in presenza di anemia che, se ben eseguiti e interpretati, consentono di impostare un primo algoritmo diagnostico. Tra gli esami di primo livello, la conta reticolocitaria è una stima del turnover dei globuli rossi e dell’attività midollare. L’esame microscopico dello striscio di sangue periferico in nessun caso è diagnostico di per sé, ma costituisce un indizio importante e a basso costo. L’emocromo mostra anemia normo o microcitica di entità variabile, spesso con aumento dell’ MCHC e delle cellule iperdense. La bilirubinemia indiretta è aumentata, l’aptoglobina è ridotta, la Ldh è aumentata, l’urobilinuria è aumentata.
Gli esami di secondo livello, aggiunti a quelli di primo livello, consentono di diagnosticare le varie forme di anemia e di definire il difetto biochimico che ne è alla base.
Essi comprendono:
- Test di fragilità osmotica, che usa soluzioni di NaCl a concentrazioni decrescenti;
- Test di lisi in glicerolo con la sua variante a pH acido;
- Pink Test;
- EMA binding Test;
- Studio delle proteine di membrana dei globuli rossi mediante Sds-elettroforesi;
Gli esami di terzo livello, infine, consistono nella caratterizzazione biochimica e molecolare dei difetti.
Presso la nostra Unità Operativa Complessa, da qualche anno, abbiamo attivato un ambulatorio per la diagnostica delle anemie congenite da difetto delle proteine di membrana.
Iniziando da una attenta valutazione del paziente e della sua storia clinica e familiare si prosegue l’iter diagnostico con gli esami di primo livello. Per i casi più difficili abbiamo messo a punto esami di secondo e terzo livello che consentono di andare avanti nella diagnostica. Tale servizio, unico nel suo genere nella nostra regione e uno dei pochi centri specializzati in Italia, consente di evitare viaggi di pazienti o di campioni presso altri centri Italiani ed ha consentito di ampliare e perfezionare la diagnostica delle anemie congenite presso l’Ematologia II.
In particolare un test di laboratorio che fa da ponte tra i test di primo e secondo livello è l’Ema Binding Test. Si tratta di un test citofluorimetrico che permette di rilevare e quantificare il segnale di emissione di fluorescenza di un colorante fluorescente, l’eosina -5- maleimede. I campioni di sangue dei pazienti con sospetta sferocitosi vengono incubati con questo colorante e quindi sottoposti all’analisi citofluorimetrica; L’intensità di fluorescenza emessa sarà proporzionale alla distribuzione della banda 3 integra sulla membrana dell’eritrocita. Nei casi in cui sia presente un deficit della banda 3 e/o di alcune delle proteine di membrana ad essa legate la quantità di colorante fluorescente assorbito sarà inferiore e di conseguenza l’intensità di fluorescenza emessa sarà minore rispetto a quella di un campione normale. Questo tipo di metodica presenta numerosi vantaggi perché il test è poco costoso, rapido, riproducibile e inoltre presenta un’alta sensibilità e specificità. Nel nostro laboratorio viene usato come test di routine per confermare la diagnosi di anemia emolitica sferocitica oppure quando persistono dubbi sulla diagnosi clinica dovuti a risultati poco chiari degli altri test di laboratorio.
Fino ad oggi abbiamo analizzato con questa metodica circa 200 campioni di soggetti normali e 100 campioni di pazienti con diversi tipi i anemie emolitiche e ciò ci ha permesso, attraverso l’elaborazione statistica dei dati, di stabilire i valori normali e patologici nella popolazione siciliana e di produrre una pubblicazione scientifica.
Nei casi in cui è importante ai fini della diagnosi chiarire la natura del deficit proteico, viene utilizzato un test più sofisticato e indaginoso che è quello dell’estrazione delle proteine di membrana dei globuli rossi e l’elettroforesi su SDS – PAGE. Si tratta di una metodica che permette di separare le proteine di membrana secondo la loro mobilità elettroforetica. Alla fine della corsa, il gel viene sottoposto ad analisi densitometrica che permette di evidenziare, attraverso un’analisi quantitativa, se è presente il deficit proteico. Questo test è anche utile per la diagnosi dell’anemia diseritropoietica congenita di tipo II in quanto nel gel SDS si evidenzia una banda III caratteristica di tale patologia.
La messa a punto di questi test e la realizzazione di un protocollo di laboratorio specifico per lo studio delle anemie emolitiche, ci ha permesso di definire numerose diagnosi cliniche dubbie.
Un ulteriore obiettivo che la nostra Unità Operativa Complessa si propone è quello del perfezionamento di alcuni aspetti dell’analisi su SDS PAGE e la messa a punto di alcuni protocolli di biologia molecolare per lo studio dei difetti genetici più importanti correlati alle anemie da alterazione delle proteine di membrana.
